mRNAワクチンおよび核酸療法の分野において、脂質ナノ粒子（LNP）は効率的な核酸送達の核となる担体として機能し、脂質材料はLNP送達の効率と生物学的安全性の重要な決定要因となります。しかし、mRNAは本質的に不安定であるため、LNP製剤は長年にわたり低温で保管する必要がありました。凍結融解サイクル中に発生する氷結晶と浸透圧ストレスは、LNPの凝集とmRNAの漏出を容易に引き起こす可能性があり、実用化には大きな制限があります。

DNA/RNA送達用添加剤の卸売、DNA/RNA送達用添加剤の専門サプライヤー

中国科学院化学研究所の研究チームは、Nature Communications誌に論文を発表し、凍結濃縮現象を利用してベタイン系凍結保護剤（CPA）をLNPに積極的に組み込むという新たな解決策を提案しました。このアプローチは、製剤の安定性を維持するだけでなく、mRNAの送達効率を大幅に向上させます。この研究は、脂質ベースの製剤の最適化に新たな視点をもたらします。

研究の背景

mRNAは加水分解、酸化、酵素分解に非常に敏感であるため、安定性を保つためには氷点下での保存が必要です。mRNA-1273やBNT162b2などの臨床的に使用されているmRNAワクチンでは、凍結保護剤としてショ糖が使用されています。しかし、凍結保護剤を使用しても、凍結融解サイクル中に2つの主要な問題が残ります。

• 物理的安定性の破壊: 氷結晶の形成と浸透圧の変化により、LNP の融合と凝集が起こり、球状構造とサイズの均一性が損なわれる可能性があります。

• 送達効率の低下: LNP の構造的損傷により、mRNA の漏出やエンドソームからの脱出が弱まり、最終的に標的細胞における mRNA 発現効率が低下する可能性があります。

既存の研究は主にLNPの「受動的な安定化」に焦点を当てていますが、この研究では凍結融解プロセス自体を革新的に利用して、凍結保護剤を単なる「安定剤」から「機能増強剤」に変換し、安定性と送達効率の二重の改善を実現します。

凍結濃縮によりBT-CPAのLNPへの組み込みが促進される

研究チームは、ベタインとトレハロースからなる複合凍結保護剤（BT-CPA）を開発しました。一連の実験を通して、凍結によってBT-CPAがLNPに積極的に取り込まれ、2つの重要な効果が得られることを実証しました。(1) 凍結融解サイクル後もLNPの構造的完全性を維持すること、(2) LNPのエンドソーム脱出能力を高めることでmRNAの送達効率を向上させることです。

最高の両性イオンポリマー卸売、プロの両性イオンポリマーサプライヤー

凍結中、水は氷結晶を形成し、残りの液相中のLNPと凍結保護剤の濃度が急激に上昇します。この現象は「凍結濃縮」と呼ばれます。このプロセスにより、LNP膜全体に急激な濃度勾配が形成され、氷結晶による機械的ストレスと脂質相転移によって引き起こされる脂質膜の一時的な隙間を通して、ベタインとトレハロースがLNP内部へ受動拡散します。

研究者らは、プロトン核磁気共鳴（¹H NMR）と高分解能質量分析を用いてこのメカニズムを検証しました。凍結融解サイクルを施したLNP+BT-CPAサンプルでは、透析によって外部の遊離BT-CPAを除去した後でも、ベタイン（3.28 ppmおよび3.83 ppmのピーク）とトレハロース（例えば、3.34 ppmのピーク）の特徴的なシグナルが検出されました。一方、凍結融解サイクルを施していないLNP+BT-CPAサンプルでは、BT-CPAの封入は最小限に抑えられていました。これは、LNPへのBT-CPAの取り込みには、単純な表面吸着だけでなく、凍結が必要であることを裏付けています。

BT-CPAの最適化：濃度と比率の正確な制御

安定性と送達効率のバランスをとるために、研究者らは BT-CPA の濃度と比率を体系的に最適化しました。

1. 複合比率の最適化：25 mg/mLベタイン単独使用ではLNPの安定性は維持されましたが、mRNAの封入効率は87 mg/mLスクロース使用時よりもわずかに低下しました。25 mg/mLトレハロースを添加（BT-CPA：25 mg/mLベタイン + 25 mg/mLトレハロース）すると、凍結融解後のLNPサイズの変化は最小限に抑えられ、mRNA封入効率は安定し、ベタイン単独使用時と比較して送達効率は1.4倍、新鮮なLNP使用時と比較して2.4倍向上しました。

2. 濃度閾値効果: ベタイン濃度を 10 mg/mL から 25 mg/mL に増加させると、mRNA 送達効率が大幅に向上しましたが、さらに 75 mg/mL に増加させても追加の利点は得られず、25 mg/mL が最適濃度であることが確認されました。

3. 凍結融解サイクルの最適化: 1～2 サイクルでは LNP 構造を損傷することなく送達効率が向上しましたが、6 サイクルでは LNP の凝集、mRNA の漏出、効率の低下が発生したため、2 サイクルが最適であることが判明しました。

BT-CPAはエンドソーム脱出を促進しmRNA送達を強化する

研究者らは、細胞実験と機構検証を通じて、BT-CPA が細胞内取り込みに影響を与えるのではなく、エンドソーム脱出を促進して mRNA 発現を促進することで送達効率を向上させることを明らかにしました。

1. 細胞内取り込みは変化せず、エンドソームからの脱出は促進：フローサイトメトリーの結果、BT-CPA処理および凍結融解処理したSM-102-LNP（BT-CPA-LNP）の細胞内取り込み効率は、新鮮なSM-102-LNPとほぼ同一であることが示されました。しかし、共焦点顕微鏡観察では、BT-CPA-LNP中のCy5標識mRNA（赤）とリソソームマーカー（緑）の重なりが著しく減少し、ピアソン相関係数（PCC）も新鮮なLNPよりも有意に低いことが示され、エンドソームからの脱出が促進されたことが示唆されました。

2. 分子メカニズム：ベタインのプロトン化が膜融合を媒介：両性イオン分子であるベタインは、酸性エンドソーム環境においてプロトン化を受け、正に帯電し、負に帯電したエンドソーム膜との静電相互作用を促進して融合を促進します。NBD-PEおよびRhod-PE標識モデルエンドソームを用いた膜融合実験では、BT-CPA-LNPにおいてNBD蛍光の消光がより強くなることが示され、融合能力の向上が確認されました。

3. 汎用性：複数の脂質との適合性：BT-CPAの増強効果はSM-102に限定されず、臨床的に使用されている様々なイオン性脂質（例：ALC-0315、MC3）にも適用されます。これらの脂質を用いて調製したLNPは、BT-CPA処理および凍結融解後にmRNA送達効率が大幅に向上し、粒子径は200 nm未満、PDIは0.2未満であり、幅広い適用性を示しています。

生体内検証：より強い免疫反応と用量節約の利点

C57BL/6マウスでは、BT-CPA-LNPは顕著な利点を示しました。

• より高い mRNA 発現: 筋肉内注射後 4 時間および 24 時間で、BT-CPA-LNP のルシフェラーゼ発現は新鮮な LNP に比べてそれぞれ 2.3 倍および 1.7 倍高くなりました。

• より強力な免疫応答：オボアルブミン mRNA（mOVA）をカプセル化した BT-CPA-LNP は、0.1 μg および 1 μg の用量で有意に高い OVA 特異的 IgG 抗体価を誘導し、ELISpot アッセイでは IFN-γ 陽性 CD4⁺ および CD8⁺ T 細胞の増加が示されました。

• 優れた長期安定性: -80°C で 6 か月後も、BT-CPA-LNP は低い細胞毒性 (DC2.4 細胞生存率 > 90%) で高い mRNA 発現効率を維持しました。

研究の意義
本研究は、LNPの凍結保護に関する新たな戦略を提案するだけでなく、凍結保護剤を、凍結中にLNPに組み込んで機能を調節できる「活性成分」として再定義します。主な貢献は以下の通りです。

1. 保管プロトコルの最適化: 低温での LNP 保管および輸送における安定性の課題に対処し、mRNA ワクチンおよび核酸医薬品の世界的な流通をサポートします。

2. 脂質用途の拡大: SM-102、ALC-0315、MC3 などの脂質が BT-CPA を介して強化された送達を実現できることを実証し、がん免疫療法や遺伝子治療の用途を支援します。

3. 革新的な製剤設計：「凍結を活用した機能強化」という概念を開拓し、LNP開発の新たなパラダイムを提案します。

結論

この研究では、凍結プロセスを戦略的に活用することで、LNP の保管上の課題を機能上の利点に変換し、SM-102、ALC-0315、MC3 などのコア脂質の配合を最適化するための貴重な技術的ソリューションを提供し、疾患治療への有望な影響をもたらします。

SINOPEGは、本研究で使用された脂質（SM-102、ALC-0315、MC3）を供給しており、ワンストップのリポソーム賦形剤と独自の脂質賦形剤を提供しています。また、多様な研究開発および製造ニーズに対応するため、高品質の多糖類およびポリ両性イオン製品も提供しています。

DNA/RNA送達用添加剤の卸売、DNA/RNA送達用添加剤の専門サプライヤー

参照
Cheng X, Zheng X, Tao K, et al. 凍結誘導による脂質ナノ粒子へのベタイン取り込みがmRNA送達を増強する. Nature Communications. 2025;16(1):4700.

私たちについて
SINOPEG は、医薬品送達、バイオ医薬品、材料科学の分野で効率的なワンストップ調達ソリューションを提供します。

テクノロジープラットフォームとコア製品:

• 医薬品/医療用 PEG 誘導体: 線状および構造化 PEG (マルチアーム、V 字型、Y 字型など)。

• 脂肪酸側鎖修飾子: セマグルチド、リラグルチド、チルゼパチド側鎖、およびペプチドリンカー。

• 脂質 (LNP) プラットフォーム: 独自のカチオン性脂質を含む包括的な mRNA ワクチン LNP 脂質。

• ADC/ProTAC リンカー プラットフォーム: 既成リンカーとカスタム リンカー。

• ブロック共重合体プラットフォーム: 高分子ミセル薬物送達キャリア。

当社の施設は ISO9001/13485/14001/45001、EcoVadis、GB/T29490 の認証を受けており、cGMP 規格と ICH-Q7A ガイドラインに準拠し、世界中のお客様に高品質の製品とサービスを提供しています。